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大家好，今天要和大医院林爱珍团队年10月发表在CarbohydratePolymers题目为“Chitosanoligosaccharidesattenuateloperamide-inducedconstipationthroughregulationofgutmicrobiotainmice”的文章。
在最近的研究中，观察到健康个体和便秘患者的肠道微生物结构不同，所以肠道微生物群失衡可能是便秘的一个重要因素。据报道，便秘延长了肠道转运时间，并增加了厚壁菌门/拟杆菌门的比例，经聚乙二醇处理后，便秘得到缓解，同时肽球菌科、真菌科和厌氧菌科的丰度降低，便秘的缓解也与双歧杆菌等有益细菌丰度的提高有关。此为，改变肠道微生物的代谢产出，如胆汁酸（BAs）、短链脂肪酸（SCFAs）和色氨酸分解物，是微生物功能紊乱导致的便秘现象。
益生元经肠道菌群发酵后改变微生物的组成和活性，从而对宿主产生良好的生物效应。在之前的研究中，益生元对难治性便秘表现出良好的疗效，如低聚果糖(FOS)、低聚异麦麦糖(IMO)和低聚半乳糖(GOS)。
图1设计方案
壳聚糖是β-(1-4)-D-氨基葡萄糖的低聚物，经脱乙酰、水解得到壳聚糖/甲壳素。与其他功能糖一样，COS对肠道细菌具有良好的调节作用。然而，COS对肠道微生物结构受损的便秘的影响尚不清楚。在此研究中，作者假设COS通过调节肠道菌群结构对便秘有有益作用。基于洛哌胺诱导的小鼠模型，研究了COS对小鼠肠道微生物失调和便秘相关理化指标的预防作用。通过液相色谱-质谱(LC-MS)与气相色谱-质谱(GC-MS)检测了肠道代谢物水平的变化。
图2COS对便秘小鼠生理参数和肠道组织损伤的影响
为了确定COS对便秘的影响，小鼠先用COS预处理2周，然后皮下注射LOP2周。结果表明，与LOP组相比，COS治疗显著抑制了便秘小鼠的体重下降，并加速了胃肠道转运率(P0.01)。为了进一步研究COS对小鼠便秘的缓解作用，作者采用组织学染色法观察了COS对小鼠肠道形态、黏液蛋白和肠道屏障的改变，通过HE染色，洛哌酰胺诱导小肠绒毛断裂不完整，而COS恢复了回肠壁和绒毛的完整性。此外，COS处理增加了结肠肌层厚度和杯状细胞的数量，通过WGA-FITC染色，便秘小鼠结肠黏液蛋白(黏液层的关键成分)的减少在COS处理后明显受到抑制。
图3COS对便秘小鼠肠道功能障碍和炎症的改善
接下来，作者通过RT-qPCR和免疫荧光染色研究COS对便秘小鼠结肠水电解质代谢、肠道黏膜屏障和肠道炎症的影响。便秘组小鼠AQP3/4和ENaC-β/γ转录水平过表达(P0.05或0.01，与Ctrl组相比)，COS处理均降低(P0.05或0.01，与LOP组相比)。在这些蛋白中，AQP3/4在肠内可将水从管腔侧输送到血管侧，ENaC-β/γ过表达可促进黏膜脱水。与Ctrl组相比，LOP组小鼠炎症介质(TNF-α、IL-1β、TLR4、NLRP3、TLR2)mRNA表达上调(P0.05或0.01)，COS组小鼠炎症介质(TNF-α、IL-1β、TLR4、NLRP3、TLR2)mRNA表达下调(P0.05或0.01)。此外，便秘小鼠结肠组织中炎症标志物(TNF-α和IL-1β)的蛋白水平升高(P0.05,vsCtrl组)，而COS处理明显抑制了这两种细胞因子的上调(P0.05,vsLOP组)(图2D-E)。考虑到CD45是一种已知的白细胞抗原，参与细胞迁移、细胞因子产生和信号转导，作者通过组织化学染色检测了CD45在有或没有COS治疗的便秘小鼠中的表达。结果表明，CD45阳性T淋巴细胞在便秘小鼠中明显增多，主要分布在结肠黏膜及粘膜下层组织。相比之下，COS处理后，这种洛哌胺诱导的免疫激活明显受到抑制。
肠道微生物群的代谢物BAs、SCFAs和色氨酸分解代谢物与肠道运动和肠道炎症高度相关。采用液相色谱-气相色谱-质谱联用(LC/GC-MS)对小鼠粪便中这些代谢物的含量进行分析。结果显示COS明显下调便秘小鼠粪便中总BAs、初级BAs和次级BAs水平(P0.05，与LOP组相比)。与此同时，作者测量了便秘小鼠粪便SCFAs和色氨酸分解代谢物的变化。结果显示，洛派丁胺注射液可降低粪便中丙酸和戊酸含量(P0.05,vsCtrl组)，COS处理可逆转这一趋势(P0.05或0.01,vsLOP组)。此外，COS可提高便秘小鼠粪便中醋酸酯含量(P0.05，与LOP组相比)。对于色氨酸分解代谢物(色氨酸、5-HT和吲哚)，COS处理显著降低了便秘小鼠粪便中吲哚含量的增加(P0.01，与LOP组相比)，而COS可使便秘小鼠的5-HT水平升高(P0.01，与LOP组比较)。
图4便秘小鼠肠道菌群失调的COS逆转，动物实验结束后将所有小鼠安乐死，收集盲肠内容物进行16SrRNA测序
作者考虑到肠道菌群失调在便秘发生中的重要意义，他们通过16SrDNA测序，探究4个实验组肠道菌群的多样性、丰富度和组成。通过Shannon指数估计微生物组样品中的物种多样性(α多样性)，与对照组相比，LOP组明显降低(P0.05)，COS治疗后明显恢复(P0.01)。表明了不同类群间的细菌结构。在门水平上，LOP组拟杆菌门(Bacteroidetes)丰度降低，厚壁菌门和Proteobacteria含量增加，COS处理显著逆转了这一趋势。同时COS降低了厚壁菌门(Firmicutes)与拟杆菌门(Bacteroidetes)的比值。经COS治疗后，LOP组小鼠的大部分变化均有统计学意义的抑制。
图5COS治疗对肠道细菌消耗小鼠便秘的影响
为了证实COS通过调节肠道微生物群来改善便秘，分别饲喂LOP、LOP+Abx或LOP+Abx+COS(1mg/ml饮用水)，与LOP组相比，LOP+Abx处理小鼠的便秘相关理化指标，包括粪便数量、粪便湿/干重和胃肠道转运率均显著提高(P0.01)。然而，与LOP+Abx组相比，COS处理并没有进一步改善这些参数。与LOP组比较，LOP+Abs组和LOP+Abx+COS组小鼠由于肠道菌群的消耗，粪便中SCFAs含量显著降低(P0.05或0.01)，而LOP+Abx组与LOP+Abx+组SCFA水平无统计学差异。以上结果表明，COS对肠道菌群衰竭小鼠的便秘没有缓解作用。
总之，此研究中，便秘小鼠粪便中总BAs含量和大部分个体BAs含量均有所增加，而COS处理后则有所减少，说明COS对BA代谢具有调节作用。相比之下，COS增加了便秘小鼠粪便中醋酸、丙酸和戊酸的水平。这些SCFAs可以促进肠道液体分泌，加速结肠运动，甚至可以作为便秘治疗的候选药物。此外，COS处理增加了便秘小鼠粪便中的5-HT水平，虽然吲哚对肠道炎症有抗炎作用，但高浓度的吲哚对周围组织有细胞毒性作用。这可能解释了便秘小鼠粪便中吲哚含量增加和COS逆转作用的原因。作者认为COS可能通过调节肠道代谢物的产生来改善便秘。COS在属水平上丰富了有益菌的相对丰度，在便秘小鼠中，COS治疗抑制了一些与便秘呈正相关的潜在致病菌，如梭状芽胞杆菌、大肠杆菌-志贺氏菌和球菌。这些结果充分说明了COS对便秘小鼠受损肠道菌群结构的重塑作用。过PICRUSt分析发现COS对肠道细菌代谢也有影响，说明COS对肠道微生物活性有调节作用。LOP-或LOP+COS处理小鼠肠道细菌的消耗进一步证实COS通过调节肠道微生物群来减轻洛哌胺诱导的便秘。此研究中使用的COS是通过壳聚糖酶解制备并膜分离，该制备方法成功获得了不含内毒素的壳聚糖。此外，结果显示，单独使用COS不能激活小鼠的促炎细胞因子的表达，进一步证明了COS产品是无脂多糖的。综上所述，作者认为是COS而不是COS-内毒素复合物对便秘起到了预防作用。
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本文编辑：佚名
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